天然多酚“化解”PD-1抑制劑耐藥！科學家首次證實，卡姆果的單多酚能夠通過腸菌，改善免疫治療的療效丨科學大發現

在遙遠而神秘的南美洲大陸上，定居着一個名喚卡姆果的龐大家族，每個小卡姆果從出生起就處於紫外線強烈的惡劣環境中，“族中的智者”爲了後代不再受活性氧的侵害，它們“身先士卒”，不斷“摸索”後終於尋到了抗氧化的不二法門。

從此，“強迫”自己將體內一部分能量“練化”成多酚和維生素C成了小卡姆果們的必修課，而這也恰是整個家族抵禦外界傷害的標誌性武器。

原以爲自此便能安穩度日，直到人類發現了它們家族的秘密……

近日，來自蒙特利爾大學研究中心的Bertrand Routy團隊，針對如何調控腸道菌羣來提高免疫檢查點抑制劑（ICI）的治療效果這一問題，在著名期刊Cancer discovery雜誌上發表了重要研究成果[1]。

他們發現，從卡姆果提取出的慄木鞣花素通過與腸道菌羣直接相互作用而具有抗腫瘤活性，不僅可以改變腫瘤免疫微環境，還能改善抗PD-1抗體 （αPD-1）治療的效果。

論文首頁截圖

免疫檢查點抑制劑的橫空出世，直接將多種惡性腫瘤的總生存率拉高了一個水平[2-4]，然而，治療耐藥性仍然是其稱霸抗癌圈的主要障礙。

目前所知的抵抗機制主要涉及以下幾個因素：PD-L1表達上調、腫瘤免疫抑制微環境以及腫瘤突變負擔[5-6]。而最近的宏基因組測序研究及無菌（GF）小鼠實驗，揭示了腸道菌羣也是決定癌症免疫治療閾值的另一個關鍵點[7]。

於是，科學家們開始致力於研究如何操縱腸道菌羣使之成爲ICI的絕佳輔助，包括糞便微生物移植（FMT）、益生菌、針對性地調整飲食等策略[8-9]。

圖片庫說，這是卡姆果本尊

卡姆果（CC）是一種原產於亞馬遜的漿果，含有多種植物化學物質，能增加腸道中嗜粘桿菌和雙歧桿菌的丰度，對小鼠肥胖和代謝相關的紊亂具有保護性益生元作用[10]。所以，Bertrand Routy團隊對卡姆果的益生元作用能否用來改變腸道菌羣，從而提高抗腫瘤活性展開了研究。

首先，研究員們對口服卡姆果的抗癌效果進行了評估，他們分別構建了對ICI治療敏感的小鼠MCA-205纖維肉瘤模型，以及對αPD-1治療抵抗的E0771乳腺癌模型，腹腔注射αPD-1或PD-1同型抗體（IsoPD-1）治療，同時，口服水或卡姆果作爲聯合治療手段。他們發現，卡姆果與αPD-1聯合治療對兩種腫瘤生長都表現出了顯著的抑制作用，而其他療法的效果則平平無奇。

αPD-1聯合卡姆果對兩種腫瘤生長的抑制效果

爲了驗證之前提出的假設—卡姆果的抗癌效果依賴於腸道菌羣，他們設計了三種不同的方案：a)無菌小鼠，口服卡姆果；b)普通小鼠，口服廣譜抗生素與卡姆果；c)普通小鼠，接受來自水或卡姆果治療過的小鼠FMT。

結果顯示，只有來自卡姆果組小鼠的FMT具有改善αPD-1治療有效性的作用，這表明卡姆果的抗癌效果確實依賴於小鼠的腸道菌羣。

卡姆果改善αPD-1治療有效性的作用依賴於腸道菌羣

那麼，卡姆果具體是怎麼影響腸道菌羣的呢？

研究員們以腸道菌羣的組成變化作爲切入點，對MCA-205模型中四組小鼠的糞便樣本進行了16S rRNA分析。擴增子序列變異（ASV）計數的結果表明，卡姆果治療與alpha腸菌的多樣性增加有關，而丰度分析則顯示，與對照組相比，卡姆果組小鼠腸道內瘤胃球菌的比例明顯增加。

腸道菌羣組成與丰度變化分析

上述結果揭示了腸道菌羣組成變化在卡姆果抗腫瘤活性中的橋樑作用，但是，從腸道菌羣丰度變化到耐藥腫瘤對αPD-1治療重新敏感，真正架起這座橋樑並溝通二者的機制卻未探明。

因此，研究員們接着對MCA-205纖維肉瘤微環境中的腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）進行了分析。他們發現，與對照組（水/IsoPD-1）相比，其他三組（卡姆果/IsoPD-1，卡姆果/αPD-1和水/PD-1）小鼠腫瘤內CD8+/Foxp3+CD4+ T細胞（Tregs）的比率有所提高，此外，卡姆果與αPD-1聯合治療顯著增加了CD8+中央記憶T細胞（TCM）的比例。

MCA-205纖維肉瘤免疫微環境的分析

爲了驗證與卡姆果相關的抗腫瘤活性是由CD8+T細胞介導的，他們建立了小鼠MCA-205纖維肉瘤模型，在卡姆果與αPD-1聯合治療過程中使用抗CD8+單克隆抗體以清除CD8+T細胞亞羣，並觀察聯合治療效果的變化。

結果發現，與對照組卡姆果/CD8+同型抗體（IsoCD8+）相比，卡姆果/抗CD8+抗體（αCD8+）組小鼠的腫瘤體積明顯增加，這說明卡姆果基於腸道菌羣的抗腫瘤作用依賴於CD8+T細胞。

阻斷CD8+T細胞亞羣后小鼠的腫瘤體積生長曲線

卡姆果組成成分複雜，包括多種具有益生元特性的多酚類物質，研究人員試圖採用高效液相色譜法（HPLC）鑑定出與調控腸道微生物有關的生物活性分子。

首先，根據分子極性，將卡姆果提取物粗略分爲極性（P）、中極性（MP）、非極性（NP）以及不溶性組分（INS）四個組分；隨後，如前述方法，分別給予荷瘤小鼠口服四種組分，並以卡姆果爲陽性對照組，比較不同組分抑制腫瘤的效果，最後發現極性組的抗腫瘤活性與卡姆果不相上下。

卡姆果粗提成分的抗腫瘤活性

於是他們進一步細化極性組的成分，將其分成四個子組分：主要由抗壞血酸組成的P1部分，主要由多酚鞣劑和沒食子酸組成的P2部分，由慄木鞣花素組成的P3部分以及由不同的複合多酚組成的P4部分。

以同樣的方法評估上述四種子組分的抗腫瘤活性，發現P3是唯一一個與卡姆果具有類似抗腫瘤作用的組分，即慄木鞣花素可能是卡姆果通過調控腸道菌羣而具有抗腫瘤活性的生物活性分子。

爲了證實上述結論的可信性，研究員們仔細地分析了慄木鞣花素對腸道菌羣的影響、抗腫瘤的作用機制以及對αPD-1治療效果的改善情況。結果表明，慄木鞣花素的抗癌活性同樣也依賴於腸道菌羣的丰度增加，進一步分析小鼠的代謝物，他們推測，慄木鞣花素通過改變腸道微生物的組成進而對代謝表型產生了影響，比如小鼠腫瘤和血清中的牛磺膽酸含量增加。

慄木鞣花素治療後小鼠的腫瘤生長曲線與代謝物分析

此外，接受慄木鞣花素治療提高了小鼠腫瘤內CD8+/Foxp3+CD4+T細胞 （Tregs）比率以及TCM的浸潤比例。

與卡姆果類似，慄木鞣花素可以有效解決αPD-1治療的耐藥性問題，並且呈現與瘤胃菌科丰度相關的劑量依賴性特徵。

不同劑量慄木鞣花素對小鼠腫瘤體積與瘤胃球菌丰度的影響

爲了進一步弄清楚慄木鞣花素與瘤胃球菌之間的相互作用，研究人員採用熒光素標記慄木鞣花素，通過流式細胞術和熒光顯微鏡發現，慄木鞣花素會優先與瘤胃球菌的細胞外被膜結合。

最後，研究人員利用無菌小鼠建立了MCA-205纖維肉瘤模型，分析發現，無論是抗腫瘤活性還是瘤胃球菌的丰度，單獨口服瘤胃球菌或慄木鞣花素都沒有明顯的作用，只有聯合使用才能將抗癌效果落實。

瘤胃球菌與慄木鞣花素對腫瘤抑制和瘤胃球菌丰度的影響

以上結果表明，慄木鞣花素經口服到達腸道後，會優先與瘤胃球菌的細胞外被膜結合，通過直接相互作用影響其丰度變化，進而促使代謝表型向有利於提高全身免疫應答的方向轉化，這便是卡姆果具備抗腫瘤活性並能夠改善ICI抵抗的原因。

總的來說，此項研究是首個證明單多酚作爲益生元能夠產生基於腸道菌羣的抗腫瘤活性的成果，意義重大，爲慄木鞣花素將來進入臨牀試驗、成爲癌症患者ICI治療的輔助劑奠定了基礎。

參考文獻：

1.Messaoudene M, Pidgeon R, Richard C, et al. A natural polyphenol exerts antitumor activity and circumvents anti-PD-1 resistance through effects on the gut microbiota. Cancer Discov. 2022; candisc.0808.2021. doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0808

2.Gandhi L, Rodríguez-Abreu D, Gadgeel S, et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 2018;378(22):2078-2092. doi:10.1056/NEJMoa1801005

3.Motzer RJ, Tannir NM, McDermott DF, et al. Nivolumab plus Ipilimumab versus Sunitinib in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 2018;378(14):1277-1290. doi:10.1056/NEJMoa1712126

4.Elkrief A, Joubert P, Florescu M, Tehfe M, Blais N, Routy B. Therapeutic landscape of metastatic non-small-cell lung cancer in Canada in 2020. Curr Oncol. 2020;27(1):52-60. doi:10.3747/co.27.5953

5.Chen DS, Mellman I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 2017;541(7637):321-330. doi:10.1038/nature21349

6.Pitt JM, Vétizou M, Daillère R, et al. Resistance Mechanisms to Immune-Checkpoint Blockade in Cancer: Tumor-Intrinsic and -Extrinsic Factors. Immunity. 2016;44(6):1255-1269. doi:10.1016/j.immuni.2016.06.001

7.Routy B, Gopalakrishnan V, Daillère R, Zitvogel L, Wargo JA, Kroemer G. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nat Rev Clin Oncol. 2018;15(6):382-396. doi:10.1038/s41571-018-0006-2

8.Daillère R, Derosa L, Bonvalet M, et al. Trial watch : the gut microbiota as a tool to boost the clinical efficacy of anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 2020;9(1):1774298. Published 2020 Jun 3. doi:10.1080/2162402X.2020.1774298

9.Baruch EN, Youngster I, Ben-Betzalel G, et al. Fecal microbiota transplant promotes response in immunotherapy-refractory melanoma patients. Science. 2021;371(6529):602-609. doi:10.1126/science.abb5920

10. Anhê FF, Nachbar RT, Varin TV, et al. Treatment with camu camu (Myrciaria dubia) prevents obesity by altering the gut microbiota and increasing energy expenditure in diet-induced obese mice. Gut. 2019;68(3):453-464. doi:10.1136/gutjnl-2017-315565

責任編輯丨BioTalker