疫苗前沿 | 自擴增mRNA疫苗：腫瘤免疫療法的全能魔法師
導讀：癌症疫苗驅動腫瘤反應性免疫細胞的激活和增殖，進而引發殺死腫瘤細胞的特異性免疫。 鑑於LNP遞送系統的成熟，體外轉錄（IVT）RNA在腫瘤免疫治療方面具有顯著的優勢，包括線性、環狀和自擴增mRNA疫苗。 其中自擴增mRNA疫苗可在低劑量下高水平表達抗原且持續時間長，同時可刺激特定的細胞免疫。
2023年，中國食品藥品檢定研究院（簡稱中檢院）研究團隊在Frontiers in Immunology（IF:5.7）上發表綜述《Amplifying mRNA vaccines: potential versatile magicians for oncotherapy》，總結了自擴增mRNA疫苗的研究進展及其在腫瘤治療中的前景和未來方向。
01
背景介紹
腫瘤免疫療法指通過激活免疫系統進行癌症治療的一系列方法，如免疫檢查點抑制劑、治療性抗體和癌症疫苗等。癌症疫苗在腫瘤的主動免疫療法中顯示出積極作用，包括根除腫瘤細胞和預防腫瘤轉移及復發，但癌症疫苗（如肽疫苗和細胞疫苗）抗原單一，抗腫瘤免疫激活效果差，生產成本高。
1995年，Conry等人首次提出使用mRNA進行腫瘤免疫治療的概念。與傳統疫苗相比，mRNA疫苗（線性、環狀和自擴增mRNA疫苗）具有可快速編輯、生物安全風險低、激活T細胞及誘導更強免疫原性等優點。其中，自擴增mRNA 疫苗 具有以下優勢 ：
（1）依賴於能利用RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）在宿主細胞內自擴增的RNA（saRNA），使載體攜帶的腫瘤抗原基因高水平、長時間表達；
（2）可在擴增過程中形成雙鏈RNA（dsRNA），具刺激免疫反應的潛力，進一步增強疫苗效果；
（3）同時表達多種抗原，誘導針對不同抗原的體液和細胞免疫應答。目前43種COVID-19 mRNA疫苗中有14種爲自擴增mRNA疫苗。因此，自擴增mRNA疫苗爲傳染病、癌症疫苗研究及應用提供廣闊前景。
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自擴增mRNA疫苗的研究歷史
自擴增mRNA疫苗的研究可追溯至1957年將從感染Mengo腦炎病毒的腹水癌細胞中提取的RNA導入細胞，可合成完整的感染性病毒顆粒。1994年Zhou等人通過使用塞姆利基森林病毒（SFV）複製子表達流感病毒核蛋白在小鼠中產生具高抗體滴度的體液反應，並首次提出使用合成自擴增mRNA作爲疫苗。1999年，Ying等人提出裸露、非感染性saRNA可用於癌症疫苗的開發。2003年，編碼前列腺特異性抗原（PSA）mRNA疫苗的臨牀試驗發現其在體內有效誘發T細胞介導的抗腫瘤免疫反應。第一個自擴增mRNA治療性癌症疫苗AVX701於2007年進入I期臨牀試驗。
自擴增mRNA疫苗技術平臺已應用於流感、呼吸道合胞病毒（RSV）、狂犬病、埃博拉病毒和HIV-1等感染性病毒疫苗及黑色素瘤等癌症疫苗的臨牀研究。
圖1 自擴增mRNA癌症疫苗發展里程碑
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自擴增mRNA疫苗作用機制
除帽、5′-UTR、3′-UTR和poly（A）尾等常規結構元件外，自擴增mRNA在5′ORF內包含一個編碼RdRp複合體（複製酶）和亞基因組啓動子的序列，編碼目標疫苗抗原的基因序列常位於亞基因組啓動子下游。SINV、VEEV、SFV等甲病毒基因組常用於自擴增mRNA疫苗的設計。自擴增mRNA進入宿主細胞後，以宿主核糖體依賴性方式翻譯，在宿主細胞內進行加工以形成複製酶，因自擴增mRNA序列爲（+）鏈RNA，可被複制酶作爲模板形成（–）鏈mRNA。（–）鏈mRNA的擴增導致兩類（+）鏈RNA的合成：一是原始全長基因組RNA副本，二是編碼目標基因的亞基因組RNA。鑑於自擴增mRNA序列中存在亞基因組啓動子和目標基因（GOI），病毒複製酶可識別（–）鏈mRNA中的亞基因組啓動子，合成大量含有目標基因序列的（+）鏈mRNA，低劑量下經翻譯獲得高水平目標產物。
圖2 自擴增mRNA作用機制
RNA穩定性與序列長度呈負相關，自擴增mRNA相較於非擴增線性mRNA額外包含編碼複製酶（7-8kb）的序列，穩定性較差。爲解決上述問題，採用分裂載體反式擴增RNA系統（編碼RdRp複合體的序列和編碼目標基因的序列分成兩個獨立的轉錄本）進行遞送，有助於控制mRNA大小，增強穩定性。
圖3 反式擴增mRNA作用機制
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自擴增mRNA癌症疫苗進展
4.1 臨牀前研究進展
自擴增mRNA癌症疫苗用於腫瘤抗原的高水平表達，在動物模型中引發強烈的細胞和體液免疫反應，有效抑制黑色素瘤、宮頸癌和前列腺癌等。該領域臨牀前研究主要集中在腫瘤相關抗原（TAA）、腫瘤特異性抗原（TSA）和免疫調節分子。
（1）TAA：對腫瘤細胞不具有特異性，但致癌過程中表達增加，臨牀前階段自擴增mRNA癌症疫苗的設計主要靶向TAA，如酪氨酸酶、pMEL17/gp100、gp75/TRP 1、MART-1/melan-A和多巴色素互變異構酶/TRP-2。Avogadri等人研究發現基於表達TRP-2的VEEV載體自擴增mRNA癌症疫苗可誘導體液免疫對抗TRP-2，在黑色素瘤的免疫治療中發揮作用，並配合腫瘤特異性CD8 T細胞反應。
（2）TSA：不存在於正常細胞，是癌症疫苗的理想靶標。超99%的宮頸癌表達E6、E7癌基因，Daemen等人使用SFV載體攜帶E6E7融合蛋白免疫的小鼠相較於單E6、E7蛋白，表現出更強的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應，導致腫瘤消退。
（3）免疫調節分子：Rodriguez Madoz等人使用表達IL-12的SFV載體治療MC38細胞繫結腸癌小鼠，顯著增強小鼠的抗腫瘤免疫應答，導致腫瘤消退和完全根除。IL-18可促進NK和T細胞分泌IFN-γ和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），並增強與抗腫瘤CTL反應相關的Th1型細胞因子的產生。
表1 臨牀前研究進展
4.2 臨牀研究進展
臨牀試驗表明，自擴增mRNA癌症疫苗可增強T細胞免疫反應並改善患者預後和生存率。2022年11月9日，JCXH-211（編碼人IL-12的新型samRNA治療藥物）被NMPA批准進入I期臨牀試驗。Vvax001（治療性疫苗）被評估在治療HPV誘導的癌症中的免疫原性、安全性和耐受性。AVX701表達修飾的癌胚抗原基因（CEA（6D）），轉移性結直腸癌患者I/II期臨牀試驗結果表明，接種疫苗的患者表現出更強的T細胞免疫反應和更長的生存期。
表2 臨牀研究進展
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自擴增mRNA癌症疫苗的優化策略
5.1 載體序列
Blakney等人開發用於編碼多種抗原的分裂複製子（splitzicon）系統，爲多價RNA疫苗的設計提供思路。Li等人開發基於VEEV複製子系統的體外進化策略，篩選出的兩種突變複製子相較於野生型複製子，熒光素酶表達的強度和持續時間顯著增加。總之，優化自擴增mRNA載體序列以減少宿主先天免疫反應可顯著提高穩定性和表達效率。
5.2 抗原選擇及組合
癌症疫苗應具備腫瘤特異性和誘導高水平且可控的抗腫瘤免疫反應的能力。TSA、TAA、免疫調節分子均用於癌症疫苗的抗原設計，現常採用聯合療法來增強癌症疫苗的效果，如多種抗原同時表達，與單抗原OVA1 mRNA相比，雙抗原OVA1和OVA2 mRNA導致T細胞抗原特異性激活增加30%，增殖增加2倍。CD40L、CD70和組成型活性TLR4編碼mRNA的共轉染可增強人樹突狀細胞誘導的T細胞活化。
表 3 臨牀和臨牀前研究中使用的癌症疫苗抗原
5.3 IVT系統
通過將質量源於設計（QbD）概念應用於IVT系統優化，可快速確定關鍵過程參數對關鍵質量屬性（CQA）的影響。Samnuan等人採用實驗設計方法研究影響IVT反應生產的自擴增mRNA產量的各種因素，確定最佳組分比，將其用於合成高產高質的自擴增mRNA。Moderna開發修飾的T7 RNA聚合酶，減少轉錄反應過程中的dsRNA雜質。新型嗜冷噬菌體VSW-3 RNA聚合酶能減少IVT過程中dsRNA副產物的產生。開發具高產率和低副產物形成的穩定IVT系統仍是未來研究的關鍵領域。
5.4 遞送系統
Miao等人使用含環狀脂質成分的LNP刺激干擾素基因通路的刺激劑用於封裝OVA mRNA疫苗，結果抗腫瘤作用顯著增強。但開發用於癌症疫苗的新型遞送系統仍存在如提高自擴增mRNA穩定性、靶向遞送效率及免疫系統激活的可控性等挑戰。
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自擴增mRNA疫苗的質量控制
世界衛生組織、國家藥品監督管理局藥品審評中心等已發佈相關指南和文件，爲監管機構提供關於mRNA疫苗質量控制的考量和mRNA質量分析的方法。序列和完整性、含量和純度、加帽和包封效率是mRNA疫苗特有的關鍵質量參數，決定其有效性和安全性。
QbD概念的應用能夠準確測定mRNA疫苗的CQA、關鍵工藝參數和操作空間，有助於爲生產過程建立合理的控制策略。爲實現自擴增mRNA疫苗的質量控制，應進一步研究關鍵的CQA，如其穩定性和體內複製酶活性。監管機構和疫苗製造商還應考慮建立參考標準，用於測量自擴增mRNA的核酸含量、純度和生物活性。關注疫苗序列完整性標誌物的質量控制也至關重要。
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總結
mRNA疫苗是癌症治療領域有前途的技術平臺。但其面臨穩定性差、抗原選擇和優化及靶向效率等障礙，在研發、生產、質量控制和安全性（自擴增mRNA疫苗可在體內不斷產生新mRNA，應注意引起強烈全身或局部炎症反應的可能性）方面仍有諸多問題有待解決。
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撰寫| 工程菌星球
校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea
編輯 設計| Alice