優立替尼在MAPK驅動的兒童低級別膠質瘤模型中顯示出良好活性

研究背景

兒童低級別膠質瘤（pLGG）是最常見的兒童中樞神經系統（CNS）腫瘤之一。儘管 10 年和20年總生存率（OS）分別爲87%和82%， 但10年無進展生存率（PFS）僅爲58%。首選的治療方法是手術切除，其他標準治療方法（SOC）包括化療（卡鉑+長春新鹼/長春地辛）和放療。pLGG被認爲是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路改變所引起的，最常見的改變爲KIAA1549：BRAF融合、BRAFV600E突變、FGFR1突變和NF1突變。因此，MAPK通路的抑制劑，如MEK抑制劑（司美替尼、曲美替尼和比美替尼）以及BRAF抑制劑（達拉非尼和維莫非尼）在臨牀試驗中取得了令人鼓舞的結果。上述藥物的客觀緩解率是30-54%。然而，與化療一樣，這些藥物經常產生副作用，導致治療停止，停藥後腫瘤反彈。

MAPK通路包括三個核心節點：BRAF、MEK和ERK。ERK是該通路的樞紐，有150多個細胞膜和細胞核下遊磷酸化靶點。ERK還參與負反饋調節，在RAF水平上調節MAPK通路，可能在BRAF抑制劑或MEK抑制劑間接抑制後使MAPK通路重新激活。因此，直接靶向ERK是治療MAPK通路異常的腫瘤的一種新穎的和有前景的方法。

優立替尼（ulixertinib，BVD523）是一種可逆的、ATP競爭性的ERK1/2抑制劑，與BRAF抑制劑聯合用於BRAF突變的黑色素瘤模型時，已顯示出協同抗腫瘤作用。本研究評估了優立替尼單藥或與MEK抑制劑、BH3模擬物（誘導體外pLGG細胞衰老）及化療聯合應用，對BRAF突變的pLGG的治療潛力。

研究方法

1、細胞培養

在增殖和衰老模式下培養毛細胞星形細胞瘤細胞系（DKFZ-BT66；存在KIAA1549:BRAF融合）和多形性黃色星形細胞瘤細胞株（BT40；存在BRAFV600E突變和CDKN2A缺失）。

2、藥代動力學研究及體內臨牀前研究

向小鼠注射BT40細胞，並通過IVIS驗證腫瘤生長情況。單一劑量組（n=28）小鼠口服優立替尼80mg/kg（每25克小鼠口服0.25ml優立替尼）。多劑量組（n=28）連續五天每天給藥兩次（每12小時一次）。藥代動力學研究在最後一次注射後持續24小時。

將BT40細胞原位移植至48只NSG小鼠體內，腫瘤生長2周後將小鼠分配至以下治療組：A：Navitoclax單藥；B：優立替尼+ Navitoclax；C：優立替尼+長春新鹼；D：載體；E：長春新鹼單藥；F：優立替尼單藥。治療自分組後3天開始，持續19天。每2周進行一次發光成像觀察。

統計圖標和分析

圖1：優立替尼在BRAFV600E突變和KIAA1549：BRAF融合pLGG細胞系中的體外活性。A、B、C分別爲BT40、DKFZBT66_ON和DKFZBT66_OFF中測得的IC50代謝活性；D、E、F分別爲在BT40、DKFZBT66_ON和DKFZBT66_OFF中測得的MAPK的IC50活性。(G）來自GDSC數據庫的IC50和BT40的IC50的彙總。（H）描述優立替尼在GDSC數據集中所有胰腺癌細胞系中IC50的箱形圖。（I）箱形圖顯示了僅來自GDSC的數據

圖2：優立替尼與MEK抑制劑、BH3模擬物或化療藥物聯用的協同作用分析和靶向活性。 A-F環形熱圖總結了測試組合的協同作用結果。最外圈：每種藥物的協同作用得分；中間圈：矩陣設計得出的平均協同作用得分；最內圈：矩陣設計得出的組合敏感性得分。G：各類藥物在不同協同作用指標和不同藥物之間的一致排名。H：基於ERK下游級聯的微型信號網絡（直接下游靶點：STAT3、P90RSK、RSK；核靶點：CREB、MSK1：CREB、MSK1；下游調控蛋白：DUSP6）。圖中顯示了相對於DMSO對照，處理細胞中蛋白質磷酸化摺疊變化。

圖3：通過高通量顯微鏡驗證各組合的協同效應結果。最外圈：協同作用得分；最內圈：組合敏感性得分。NA，協同作用計算不適用。K：A-J的一致排名。

圖4：斑馬魚驗證。A：用於評估優立替尼、比美替尼、Navitoclax和DMSO治療72h後毒性的代表性示例圖片。MTD：最大耐受劑量；LD：致死劑量。B：斑馬魚胚胎腫瘤移植示例圖片。刻度線代表100微米。C：熱圖顯示斑馬魚根據RECIST1.1採用的進展性疾病（PD）與部分緩解（PR）的比率，使用log10轉換值。S：溶劑；D：相關藥物；U：優立替尼；C：和相關藥物的組合。比美替尼（B）或Navitoclax（N）

圖5：優立替尼在體內的藥代動力學數據和臨牀前評估。A：兩個給藥組別（單劑量和多劑量組）第1-7組的血液採集情況。關鍵時間點定義爲0.5-24小時（用粗體表示）。每隻小鼠進行了三次血液採集和一次額外的心臟穿刺末端採集。B-C：優立替尼藥代動力學實驗的研究設計。D：單劑量和多劑量組羣的優立替尼血漿和腦濃度。E：研究設計時間表。F：治療小鼠的生物發光圖像。動物每週成像兩次，直至達到終止標準。生物發光信號顯示爲平均輻射度，範圍爲1.0E6-1.0E8光子/秒/平方釐米/晝夜。G：對所有接受治療的動物進KaplanMeier存活率分析（每組8只）。

結果

1、優立替尼在BRAFV600E突變型和KIAA1549：BRAF融合細胞系中可以達到具有臨牀活性的濃度

爲了研究優立替尼的體外抗腫瘤活性，研究者使用了BRAFV600E突變模型和KIAA1549：BRAF融合模型DKFZBT66。在BT40中，優立替尼在臨牀可達到的濃度下降低了代謝活性，IC50爲62.7nM（圖1A）。優立替尼不影響DKFZBT66增殖細胞（圖1B）或衰老細胞（圖1C）的代謝活性，這與之前觀察到的各種MAPK抑制劑一樣。這些數據表明優立替尼在BRAFV600E突變和KIAA1549：BRAF融合的pLGG細胞中存在臨牀活性。

2、優立替尼與MEK抑制劑或BH3模擬物在體外具有協同作用

研究者探索了優立替尼與MEK抑制劑（比美替尼、司美替尼、曲美替尼）、BH3模擬物（A1331852、Navitoclax、Venetoclax）和標準化療（卡鉑+長春新鹼）聯合使用的潛在抗腫瘤作用。除Venetoclax和卡鉑外，所有單藥的代謝IC50 都達到了臨牀可達到的濃度。

在BRAFV600E突變模型中，優立替尼聯合曲美替尼、比美替尼或A1331852顯示出協同作用或加成作用（圖2A）。還觀察到了與比美替尼聯用時的同步交互作用（圖 2B）。在增殖的KIAA1549：BRAF融合模型中，優立替尼與BH3模擬物聯用具有協同作用。與Venetoclax的協同作用得分最高，但其濃度高於臨牀可達到的水平。與化療藥物聯合時顯示出整體緩衝拮抗作用（圖2C）。與比美替尼和曲美替尼的組合顯示出很強的協同作用，而與司美替尼的組合則顯示出緩衝拮抗作用（圖2D）。在衰老的KIAA1549：BRAF融合模型中，優立替尼與BH3模擬物的組合顯示出協同作用，與Navitoclax或A1331852聯合時效果最佳（圖2E）。與比美替尼和曲美替尼的協同作用得分最高（圖2F）。

根據協同作用得分排序最終確定MEK抑制劑比美替尼和曲美替尼以及BH3模擬物Navitoclax和A1331852爲優立替尼的最佳聯合藥物。（圖2G）。化療藥物中與優立替尼聯合的最佳藥物爲長春新鹼。另外，由於A1331852目前尚未進行臨牀評估故被排除。

通過RPPA和Western印跡對幾個ERK下游靶點進行了研究（圖2H），可發現優立替尼處理後的樣本出現ERK靶點磷酸化，並且在所有組合中都觀察到了優立替尼的劑量依賴性效應。因此所有研究組合都具有靶向活性。

3、驗證比美替尼和Navitoclax與優立替尼在體外/體內可有效協同

在BT40細胞中，單獨應用優立替尼、MEK抑制劑、Navitoclax和長春新鹼會減少細胞數量，抑制細胞活性。與單獨應用曲美替尼、比美替尼和Navitoclax相比，聯合應用Navitoclax及優立替尼時觀察到最強的誘導細胞凋亡效應。在優立替尼與比美替尼、司美替尼和長春新鹼的組合中測定了細胞增殖和活力（圖3A-B）的協同作用得分。其中優立替尼與比美替尼或Navitoclax的組合對細胞死亡有協同作用（圖3C）。優立替尼與比美替尼、曲美替尼、Navitoclax和長春新鹼的組合可協同誘導細胞凋亡（圖3D）。

在DKFZ-BT66細胞中，無論是增殖細胞和衰老細胞中測試的所有組合中都發現了拮抗增殖和縮小細胞體積的效應（圖3E-H）。但對誘導細胞死亡的效應充其量是相加的（圖3I-J）。根據協同作用得分對所有藥物進行排序，發現比美替尼、Navitoclax 和長春新鹼是優立替尼的最佳聯合藥物（圖3K）。

迄今爲止，斑馬魚胚胎模型是研究體內pLGG細胞衰老的唯一選擇。用優立替尼處理未注射的斑馬魚胚胎以確定各自的最大耐受劑量（MTD）和致死劑量（LD）（圖4A）。斑馬魚胚胎對優立替尼的最大耐受劑量爲2.5µM。根據進展性疾病與部分反應（PD/PR）的比率評估了pLGG異種移植瘤在治療後的生長情況（圖4B）。只有在增殖的DKFZBT66_ON異種移植瘤中，優立替尼的PD/PR比值才小於1.0（圖4C）。在所有其他模型中，只有聯合治療才能達到這種效果，且療效大大增加。在所有三個模型中，pLGG與Navitoclax聯合治療的PR率均優於與比美替尼聯合治療的PR率（BT40：54% vs. 33%；DKFZ-BT66_ON：67% vs. 36%；DKFZ-BT66_OFF：23% vs. 22%）。這些數據確定了Navitoclax與優立替尼聯用是抑制BRAF驅動的pLGG腫瘤生長的有前景的組合，有待在體內進一步驗證。

4、優立替尼在小鼠體內的毒性、藥代動力學和藥效學研究

用優立替尼對NSG小鼠進行每天兩次、連續五天的治療不會導致體重下降，平均體重變化爲-1.67±5.84%，而體重下降是毒性的替代指標。藥代動力學研究在BT40異種移植（PDX）小鼠中進行。在單劑量和多劑量組中的24h時間窗內進行採樣（圖5A-C）。使用健康大腦和腫瘤區域（腫瘤、小腦、皮層/其他腦區）的組織勻漿測定腦內的總優立替尼濃度（圖5D）。腫瘤腦組織和健康腦組織的優立替尼濃度是相當的。優立替尼對血腦屏障的穿透率較低，與血漿相比，其腦內濃度僅爲1.76%。儘管如此，在兩個隊列中，優立替尼的腦部總濃度在用藥後的最初12小時內均超過了有效的體外IC50濃度（30.4ng/g）。因此，腦部潛在有效濃度在穩態時就已達到。爲了驗證這一點，研究者通過WesternBlot法對兩個治療組的健康腦組織和腫瘤腦組織中的優立替尼體內靶向活性進行了研究。優立替尼對DUSP6蛋白的抑制具有時間依賴性。與測得的總藥物組織濃度相關。惡性腦組織與健康腦組織之間無差異。

5、優立替尼對小鼠pLGG模型的體內抗腫瘤療效

移植後2周開始使用前述藥物治療，優立替尼在PDX小鼠模型中表現出顯著的抗腫瘤活性（圖5F），並減緩了腫瘤的生長（P=0.0019），優立替尼治療小鼠的中位生存期爲48.5天，而接受載體的小鼠爲30天（圖5G）。Navitoclax或長春新鹼與優立替尼聯合治療都不能顯著改善療效（圖5G）。研究者測量了腫瘤組織中的Navitoclax濃度，發現只有Navitoclax單藥治療組的3/6只小鼠和聯合治療組的1/6只小鼠的腫瘤組織濃度高於體外Navitoclax有效濃度IC50以上，這可能是聯合使用Navitoclax治療的療效較低的原因。值得注意的是，在抑制腫瘤生長方面，優立替尼的表現優於化療（長春新鹼）（圖5G）。然而，在治療結束後，所有幸存者的腫瘤生長都加快了，這凸顯了優立替尼的細胞抑制活性（圖5F）。雖然所有治療方案的耐受性都很好，但一些接受Navitoclax或長春新鹼治療的小鼠出現了輕微的體重減輕（<20%），這與腦腫瘤相關症狀無關。

新型候選藥物的臨牀前研究是開展新臨牀研究的必要前提。臨牀前研究可以評估藥物的臨牀潛力，並且預測潛在的不良反應。本研究是首次對第一代ERK抑制劑優立替尼在BRAF驅動的pLGG模型的抗腫瘤活性進行的臨牀前研究。該藥在BRAFV600E突變（BT40）模型中顯示出顯著的有效性，在BRAF融合模型中，優立替尼對MAPK通路也表現出了相當的抑制效應，包括DKFZBT66_ON（可反映進展風險高的患者）和DKFZBT66_OFF（可反映進展風險低的患者）。在增殖和衰老模型中也觀察到明顯的MAPK抑制效應，說明優立替尼可能對穩定和進展型的pLGG具有同樣的療效。此外，優立替尼在臨牀可達到的濃度下具有很強的藥效，另外沒有觀察到與ERK相關的負反饋環抑制導致MAPK激活的矛盾現象。

體內研究證實，優立替尼在有效濃度下具有良好的耐受性，其藥代動力學特徵與之前公佈的人體I期藥代動力學數據一致。本研究證明了優立替尼在腦組織的濃度足以誘導MAPK通路抑制，這與優立替尼之前在多形性膠質母細胞瘤和腦轉移瘤臨牀試驗中證明的中樞神經系統活性一致。優立替尼在健康組織和腫瘤組織中的分佈情況相似。其濃度高於體外IC50，其對MAPK通路替代標記物DUSP6的抑制作用也證實了這一現象。優立替尼對正常組織的影響並沒有損害小鼠的健康，這可以通過對體重下降、行爲等監測來評估。

優立替尼延緩了腫瘤的生長，並顯著提高了BT40細胞的存活率。在BT40-PDX小鼠模型中，優立替尼可延緩腫瘤生長並顯著提高小鼠的存活率，這可能是通過誘導細胞死亡實現的，體外研究也證明了這一點。在生存期方面，優立替尼的療效優於化療藥物，這與另一項臨牀前研究一致，該研究顯示優立替尼在BRAFV600E驅動的黑色素瘤A375PDX小鼠模型中的生存期顯著優於替莫唑胺。總之，本研究表明優立替尼在BRAF驅動的pLGG中具有較高的臨牀價值，並將支持開展對pLGG的單藥和聯合療法進行評價的I/II期研究。

有少數幾種藥物已被研究與優立替尼聯合應用，如與帕博西利（palbociclib）聯合治療晚期胰腺癌和其他腫瘤（NCT03454035），或與羥氯喹聯合治療胃腸道腺癌（NCT04145297）。目前尚缺乏可靠的pLGG模型，現有模型不能完全體現pLGG的生物學特性，僅有BT40和DKFZ-BT66可用於建立大規模篩選藥物的動物模型。既往研究發現BRAF抑制劑達拉非尼與優立替尼聯用可協同抑制MAPK活性。在體外pLGG模型中I型或II型RAF抑制劑和ERK抑制（包括優立替尼和第二代I型BRAF抑制劑encorafenib）聯合使用可協同抑制MAPK活性。另外，ERK和MEK抑制劑聯合應用可廣泛持久地抑制MAPK活性，特別是MEK抑制劑比美替尼在體外研究中協同作用最強，並在斑馬魚胚胎模型中與優立替尼聯用顯示出抗腫瘤潛力。有趣的是，在BRAFV600E突變模型中，司美替尼與優立替尼聯用顯示出協同作用，但在KIAA1549：BRAF融合模型中僅顯示出加成效應。這表明司美替尼與優立替尼聯用可能會對BRAF V600E突變的pLGG產生療效，這在臨牀上很有意義，因爲與KIAA1549：BRAF融合的腫瘤相比，司美替尼單藥治療BRAF V600E突變的pLGG的PFS更低。

本研究證明了在所有BRAF驅動的pLGG模型中優立替尼與BH3的模擬物有明顯的協同作用。Navitoclax在體外始終顯示出與優立替尼的協同作用，並在斑馬魚胚胎模型中顯示出最高的PR率。Bcl-xL抑制劑A1331852在體外研究中顯示出最強的協同作用。令人鼓舞的臨牀前數據支持使用BH3模擬物靶向誘導癌細胞衰老。因此，使用Bcl-xL抑制劑可能是一種很有前景的pLGG治療方法。

總之，我們的數據證明了ERK抑制劑優立替尼治療BRAF驅動的pLGG的臨牀療效，並將支持在針對復發pLGG的I/II期研究中對其單藥和聯合用藥的療效進行首次評估。

參考文獻：RomainSigaud et al. The first-in-class ERK inhibitor ulixertinib shows promising activity in mitogen-activated protein kinase (MAPK)-driven pediatric low-grade glioma models. Neuro-Oncology. 25(3), 566-579, 2023

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撰稿：孔晨晨

審校：張俊平

排版：張靜靜